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Stem-loop实时定量 RT PCR技术

传统实时定量RT PCR只能检测到miRNA前体,而Stem-loop实时定量RT PCR技术可以解决这一问题。Stem loop实时定量RT PCR是一项高特异度、敏感度的检测miRNA表达的实验技术,包括设计具有茎环(stem loop)结构的反转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针进行实时PCR 二个关键步骤。该技术具有以下优点:高度特异性,对序列高度同源的miRNA也可精确区分;超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度;样品消耗少,仅需1~10 ng的总RNA;适用范围广,总RNA 、细胞裂解物以及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测。


microRNA的RT-PCR一般使用茎环结构的引物,这种具有茎环结构的引物针对所需检测的目的microRNA设计,具有特异的序列。内参使用的是小RNA U6,U6的反转录使用的是随机引物。将反转录的产物作为real-time PCR的模板,检测目的microRNA的引物是针对目的microRNA的特异的上下游引物,检测内参使用的是针对U6的特异的上下游引物。


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