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亚细胞分级分离

发布时间:2022/6/30 15:03:26

亚细胞分离是研究特定的细胞内结构、细胞器、蛋白或评估这些大分子结构之间联系性的一个重要步骤。亚细胞分级分离利用亚细胞结构的其中一个或多个属性,如浮力密度、表面电荷密度、尺寸和形状等,主要根据其在4下高粘度的介质中的差速离心而进行分离。用于差速离心的介质主要有蔗糖、甘露醇,甘油,Ficoll 400(蔗糖的多聚物),Percoll(胶体二氧化硅)和碘克沙醇(OptiPrep)。蔗糖被广泛使用是因为它价格低廉。但这些介质都有各自的优点和局限性, HarfordBonifacino 2011年的文章中对此有详细讨论。本文将主要阐述这些方法,但偏重于那些容易为大多数实验室所操作,而且耗时少的方法,因为快速分离至关重要。凝胶过滤、亲和层析、电泳或选择性密度迁移干扰等方法也可使用。现有操作规程的条件改变是取决于所分离的细胞器、组织或细胞类型和所使用的设备。强烈建议阅读所引用的参考文献中每个操作规程的全部细节。最后,需要通过特定标记物的检测来确定整个分离过程中所搜集的各组分的的纯度和产率。

下面将阐述最常用的亚细胞器分离的方法。鼠肝亚细胞器的分离在文献中已有详细描述而且很容易找见,因此本部分综述的重点是在其他模型系统的亚细胞器分离。

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细胞质、核质和染色质的分离

细胞质、核质和染色质组分可以很容易地从收集的培养细胞中制备 [] 。将细胞重新悬浮在含有0.34 M的蔗糖、10%甘油、低浓度的温和洗涤剂(0.1%的Triton X-100),以及含K +Mg + 2(保护核不受破裂)的缓冲液中。通过低速离心将细胞核沉淀下来而上清液则为细胞质组分。然后,在含有螯合剂EDTAEGTA的缓冲液中核进行裂解,不可溶的染色质组分通过低速离心进行沉淀,而上清液则为核质组分 [] (图1)。

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一些研究人员使用一种快速和粗略的方法从细胞质/核质分离制备染色质及其相关蛋白。这种方法简单地通过在含有1Triton X-100的裂解缓冲液中将细胞进行裂解。在此缓冲液中,染色质和一些细胞骨架结构是不溶性的,它们可以通过离心回收。沉淀物部分可以重新悬浮用于SDS-PAGE电泳之类的 Laemmli样品缓冲液中 [

 

通过差速离心分离线粒体

将单层贴壁或悬浮生长的细胞沉淀物在含有氯化镁和氯化钾的匀浆缓冲液中进行匀浆,然后加蔗糖至浓度为0.25 M,通过低速离心先将核进行沉淀 (1000 g)。把上清液以5000 g进行第二次离心可得到线粒体沉淀。将沉淀物重新悬浮在含蔗糖和Mg+2 的介质中,用Dounce匀浆器进行几次轻柔的匀浆,最后一次离心可以富集线粒体然后将它悬浮在含0.25 M 蔗糖的Tris 缓冲液中或者悬浮在进行下一步分析所需要的缓冲液中(如Laemmli ) [3] 。

用酵母裂解酶处理酵母细胞以裂解坚硬的外壁,生成的原生质球用山梨糖醇缓冲液进行洗涤。将所得的沉淀物重新悬浮在含0.6 M的甘露醇匀浆缓冲液,并用Dounce匀浆器进行匀浆几次以裂解。细胞核可以通过低速离心去除,含细胞质的上清液则用一个角度固定的转子以6500 g 速度进行离心而沉淀下线粒体。

 

过氧化物酶体的分离

   Smith [] 把经2,000 g 离心的去核上清液再进行20,000 g 离心 30分钟,得到的沉淀含有过氧化物酶体和线粒体,然后将其重新悬浮在MS 缓冲液中( 0.65 M山梨糖醇, 5 mM MES, pH 5.5),加入到同样溶于MS 缓冲液中的Nycodenz 密度梯度的上层 (17%, 25%, 35%, 50%) 116,000 g 离心2小时, 过氧化物酶体将会存在于第2 到第8 层中。Fujiki (1982) Nuttley1990)等进一步分离了过氧化物酶体膜的相关蛋白,引用参见 [] 。将前述经20,000 g 离心收集的沉淀重新悬浮在10倍体积的Ti8 缓冲液中 Tris 10mM, pH 8.0 PINS (1 mM EDTA, 0.2 mM PMSF, 2 μg leupeptin/ml, 2 μg aprotinin/ml 以及0.4 μg pepstatin A/ml)】, 然后在200,000 g 离心 1 小时。所得的沉淀重新悬浮于Ti8 缓冲液 中并加入0.1 M的碳酸钠再进行 200,000 g 离心1 小时,过氧化物酶体膜就与那些与膜相连但不整合在膜上的蛋白分离开来了。

 

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常见问题

怎样从植物组织中分离叶绿体?

将植物组织匀浆重悬在在等渗介质中(0.35 M氯化钠或0.4M蔗糖溶液)以尽量减少对叶绿体的任何破坏,以1000 rpm离心2分钟以除去组织残片和剩余的细胞,然后在3000 rpm下离心5分钟以获得叶绿体沉淀。离心应在05°C下进行。

分离所得的线粒体能够维持它们的生理活性和功能吗?

可以。离心力不损伤线粒体结构。此外,离心缓冲液对线粒体有保护作用。

 


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