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Trizol法提取细胞RNA

发布时间:2022/6/30 21:20:29

Trizol法是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。

虽然Trizol里面含有RNA酶抑制剂的,1ml的Trizol一般最多只能裂解100mg的组织。但是如果组织过量,Trizol无法完全浸润组织无法完全裂解组织,多余组织内的RNA酶等物质会导致RNA的降解。这是RNA降解的很重要的原因。

同时,由于RNA容易降解,在实验过程中一般都要求口罩的,避免组织的污染。同时选用的无RNA酶的枪头、EP管以及DEPC水。

实验提取步骤:

标准Trizol提取步骤为液氮研磨--加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--离心--加入氯丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心。

1将细胞培养皿置于冰上,加入Trizol裂解5-10分钟,用枪头轻轻吹打后吸取液体放入EP管中。

2加入1/5体积的氯仿,上下混匀液体,4度静置10-15分钟。(氯仿为有机溶剂,有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和RNA脱离,RNA进入水相)。

3离心15分钟。离心后分成三层,RNA在上清里,从离心机轻轻拿出EP管,以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。吸取上清的时候一定要动作轻柔,切忌吸取太多,一般吸到400-500ul,避免吸到下层沉淀,将液体置于新的EP管中。

4加入等体积异丙醇,4℃静置10min,然后离心10min。异丙醇主要用于沉淀RNA。

5取出EP管后可以见到侧壁沉淀,轻轻吸弃上清。

6向EP管中加入75%酒精洗涤沉淀,帮助分离剩余的有机试剂(剩余有机试剂过多会影响OD值和PCR反应),轻弹沉淀,使其浮在酒精,静置1-2min,让酒精充分接触沉淀,充分溶解有机试剂,然后离心5min。轻轻吸弃上清。

7将EP管再次放于离心机中瞬时离心,弃掉管壁残余液体。然后将EP管置于超净台中干燥5-10min.。注意RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。

8加入50ul DEPC处理水,震荡充分溶解沉淀。

9测量RNA浓度。将RNA保存于-80度。


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